猪流行性腹泻概述

猪流行性腹泻是猪的一种严重传染病，其症状与猪传染性胃肠炎相似，病毒形态上也基本相同，但两者的抗原性不一样。本标准规定了猪流行性腹泻的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验，检测抗体的血清中和试验、间接ELISA试验技术。

病毒分离与鉴定

病毒分离与鉴定是诊断猪流行性腹泻的关键步骤。本标准规定了病毒分离与鉴定的具体操作方法，包括材料准备、病毒分离、接种及观察、结果判定等。

材料准备

病毒分离与鉴定所需材料包括倒置显微镜、冷冻离心机、微孔滤器、细胞培养瓶、盖玻片、温箱等器材，以及磷酸盐缓冲液、细胞培养液、病毒培养液及N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸液等溶液。

病毒分离

病毒分离主要包括病料采集、病料处理、接种及观察等步骤。采集病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒，样品冷冻保存。将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000 IU/mL青霉素、1000μg/mL链霉素、PBS液制成5倍悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存备用。

接种及观察

将过滤液接种于Vero细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37℃吸附1h，根据组织培养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培养，逐日观察3d～4d，按致细胞病变作用变化情况，可盲传2代～3代。

直接荧光抗体法

直接荧光抗体法是检测猪流行性腹泻病毒抗原的一种常用方法。本标准规定了直接荧光抗体法的材料准备、操作方法、结果判定等。

材料准备

直接荧光抗体法所需材料包括荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等器材，以及荧光抗体、磷酸盐缓冲液、0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油等溶液。

操作方法

操作方法包括标本片的制备、FA染色、结果判定等步骤。采急性期内患猪空肠中段的粘膜上皮做涂片或肠段做冷冻切片，丙酮中固定10min，置PBS中浸泡10min～15min，风干或自然干燥。用0.02%伊文思蓝溶液将FA稀释至工作浓度，4000r/min离心10min，取上清液滴于标本上，37℃恒温恒湿染色30 min，用PBS冲洗3次，依次为3min、4min、5min，风干，滴加磷酸盐缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。

结果判定

判定标准：在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应完整清晰。并在阳性、阴性对照均成立时判定。在胞浆中见到特异性苹果绿色荧光判定为阳性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。

双抗体夹心ELISA

双抗体夹心ELISA是检测猪流行性腹泻病毒抗体的一种常用方法。本标准规定了双抗体夹心ELISA的材料准备、操作方法等。

材料准备

双抗体夹心ELISA所需材料包括定量加液器、微量移液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪等器材，以及猪抗PED-IgG及猪抗PED-IgG-HRP等溶液。

操作方法

操作方法包括冲洗包被板、包被抗体、加样品等步骤。向各孔注入无离子水，浸泡3min甩干，重复3次，甩干孔内残液，在滤纸上吸干。用包被稀释液稀释猪抗PED-IgG至使用倍数，每孔加100μL，置4℃过夜，弃液，用洗液冲洗3次；每次3min。将被检样品用样品稀释液做5倍稀释，加入两孔，每孔100μL，每块反应板设阴性抗原、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置37℃作用2h，弃样品，冲洗同4.2.2。

生态保护与可持续发展

在养殖过程中，我们要始终贯穿“生态保护”与“可持续发展”的理念。通过采用猪流行性腹泻快速检测技术，我们可以提高养殖效益，同时保障环境健康。这不仅有助于养殖业的可持续发展，也有利于生态保护。

预测与验证

随着科技的不断发展，猪流行性腹泻快速检测技术将更加成熟，为养殖业提供更加便捷、高效的检测手段。我们相信，在不久的将来，猪流行性腹泻的防控将取得更大突破。欢迎用实际体验验证我们的观点。